拼音名：Bushijun Chundanbai Yanshengwu
英文名：Purified Protein Derivative of Brucellin (BR-PPD)
书页号：2005年版三部－256
本品系用布氏菌经培养、杀菌、过滤除去菌体后纯化制成，用于布氏病的临床诊断、布氏菌苗接种对象的选择及布氏菌苗接种后机体免疫反应的监测。
1 基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
布氏菌纯蛋白衍生物(BP-PPD)生产车间必须与其他生物制品生产车间及实验室分开，原液生产全部过程，包括布氏杆菌的灭活，应在完全隔离的区域内进行，所需设备及器具均须单独设置并专用。直接用于生产的金属或玻璃等器具，应经过严格清洗及灭菌处理。
2 制造
2.1 菌种
生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
2.1.1 菌种名称及来源
生产用菌种为猪布氏菌Ⅰ型CMCC 55007(S2)菌株。
2.1.2 种子批建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的有关规定。
2.1.3 种子批的传代
自工作种子批至菌体收集，菌种传代不应超过12代。
2.1.4种子批的检定
2.1.4.1 染色镜检
菌体染色后镜检应为革兰阴性小杆菌。
2.1.4.2 生化特性
1：1000三胜黄素做变异检查应为阴性；在硫堇培养基能生长；在碱性复红培养基不生长；培养生长中可产生明显的硫化氢，不需二氧化碳。
2.1.4.3 血清学特性
生产用菌种对布氏菌参考血清的凝集效价应达到1：800(++)以上。
2.1.4.4 噬菌体裂解特性
能被布氏菌Wb噬菌体裂解。
2.1.5 种子批的保存
冻干菌种于2～8℃保存，液体菌种于－70℃以下保存。
2.2 原液
2.2.1 生产用培养基
采用肝浸液琼脂培养基或经批准的其他培养基。
2.2.2 菌种接种和培养
启开菌种后接种于肝琼脂斜面培养基，置37℃培养2～3天，根据生长情况，可在肝琼脂斜面上再传代1次，生长良好的菌苔，可供大量接种使用。
2.2.3 大量接种
取2.2.2项生长良好的菌苔，接种于适量的大管肝斜面或克氏瓶中作为种子，置37℃培养2天。用以接种的大管肝斜面或肝琼脂克氏瓶，于37℃培养2天。
2.2.4 杀菌和除菌
培养终止，以生理氯化钠溶液洗脱培养物，121℃30分钟杀菌，杀菌后离心除去菌体，收集上清液。
2.2.5 上清液收集和保存
收集上清液进行纯化。如上清液需保存应加入3.0g/L苯酚或其他适宜的防腐剂，保存于4～8℃，保存期不超过30天。应防止冻结。
2.2.6 纯化
用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白质，采用经批准的方法纯化，除菌过滤后即为原液。
2.2.7 合并及冻干
2.2.7.1 合并
将不超过5次纯化的原液进行合并。
2.2.7.2 分装及冻干
原液检定合格后，可根据蛋白质含量，将原液稀释至规定浓度，定量分装，分装后立即进行冻干。
2.2.8 原液检定
按3.1项进行。
2.2.9 原液保存及有效期
原液应保存于2～8℃。液体原液自效价测定合格之日起有效期为5年；冻干品自效价测定合格之日起，每间隔5年应按3.1项进行检定，合格后方可继续使用。
2.3 半成品
2.3.1 配制
经检定合格的原液，用0.01mol/L PBS(pH7.2～7.4，含0.0005%聚山梨酯80及3.0g/L苯酚)稀释至20IU/ml或50IU/ml。稀释时应充分摇匀，并逐瓶抽样做无菌检查(附录Ⅻ A)。
2.3.2 半成品检定
按3.2项进行。
2.4 成品
2.4.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.4.3 规格
每瓶1ml、2ml。每1次人用剂量0.1ml，含BR-PPD 1U。
2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”规定。
3 检定
3.1 原液检定
3.1. 1 外观
原液冻干品应为白色疏松体。液体原液及冻干品复溶后应呈棕黄色澄明液体，无不溶物或杂质。
3.1.2 复溶时间
冻干品按标示量加入注射用水后，应于3分钟内完全溶解。
3.1.3 水分
应不高于3.0%(附录Ⅶ D)。
3.1.4 纯度
3.1.4.1 蛋白质含量
依法测定(附录Ⅵ B第一法)。
3.1.4.2 多糖与核酸含量
每1mg蛋白质含多糖与核酸总量应不高于0.1mg。
(1) 多糖含量测定：以生理氯化钠溶液稀释无水葡萄糖标准品，制备0～100μg/ml标准葡萄糖溶液。将硫酸225ml加入到75ml生理氯化钠溶液中，另称取蒽酮0.6g加入10ml乙醇中，将上述溶液混合，配制成蒽酮混合液。分别精确量取1.0ml不同浓度标准葡萄糖溶液以及本品，加入4.0ml蒽酮混合液，混匀，沸水浴20分钟后于波长620nm处测定吸光度，以葡萄糖标准溶液浓度对应其吸光度，用minitab或其他统计学方法求回归方程，代入本品吸光度，计算多糖含量。
(2) 核酸含量测定：取供试品2～3ml，采用紫外-可见分光光度法(附录Ⅱ A)，于波长260nm处测定吸光度值，按E1%{1cm}=200计算核酸含量。
3.1.5 效价测定
3.1.5.1 动物法
将标准品及本品分别稀释3个不同稀释度，取至少4只已经布氏菌致敏的体重为400～600g的白色雌性豚鼠，去毛后于背部脊柱两侧相对部位，分别皮内注射上述稀释度本品各0.1ml或0.2ml，于注射后24小时、48小时各观察局部硬结的纵径与横径(可根据48小时的反应结果判定)。计算每个稀释度2天的硬结反应总和或平均面积，并求其比值，每个稀释度本品与相应浓度标准品的比值应为0.8～1.2，如不符合上述要求，可调整稀释度后再测定效价，直至符合要求。
3.1.5.2 稀释度选择
稀释度的选择应能使本品注射后24小时所产生的局部硬结反应直径为10～30mm；本品和标准品的反应直径大小应相似，且本品和标准品的3个稀释度的剂量对数反应线应基本平行。如本品效价与标准品效价不一致，可用同样方法复试1次，并算出相当于标准品的效价，进行调整，调整后再重新抽样测定效价，直至符合要求。
3.1.6 无菌检查
依法检查(附录Ⅻ A)，应符合规定。
3.1.7 异常毒性检查
依法检查(附录Ⅻ F)，应符合规定。
3.1.8 致敏效应试验
试验组与对照组分别用体重300～400g未做过任何试验的豚鼠各3只。试验组每只豚鼠皮内注射0.2ml含20μg的本品，共3次，每次间隔5天。在第3次注射后15天，试验组与对照组每只豚鼠各皮内注射0.2ml含20μg的本品，连续观察3天，两组动物反应应无明显区别。
3.2 半成品检定
无菌检查
依法检查(附录Ⅻ A)，应符合规定。
3.3 成品检定
3.3.1 鉴别试验
取已经布氏菌致敏的豚鼠至少4只，皮内注射0.2ml本品，注射后24小时本品的平均硬结反应均应不小于5mm。
3.3.2 外观
应为无色澄明液体，无不溶物或杂质。
3.3.3 化学检定
3.3.3.1 pH值
应为6.8～7.4(附录Ⅴ A)。
3.3.3.2 苯酚含量
应不高于3.0g/L(附录Ⅵ M)。
3.3.4 效价测定
取已经布氏菌致敏的400～600g豚鼠，皮内注射0.2ml标准品与本品，至少各4只，注射后24小时、48小时各观察结果1次(可根据48小时的反应结果判定)，计算本品和标准BR-PPD的平均硬结反应(纵横直径相加除以2)，计算累计值，并求其比值，应为0.8～1.2。
3.3.5 无菌检查
依法检查(附录Ⅻ A)，应符合规定。
3.3.6 异常毒性检查
依法检查(附录Ⅻ F)，应符合规定。
4 保存、运输及有效期
于2～8℃避光保存和运输。自分装之日起有效期为1年。
5 使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定。
