拼音名：Yixing Naoyan Jiandu Huoyimiao
英文名：Japanese Encephalitis Vaccine，Live
书页号：2005年版三部-77
本品系用乙型脑炎(简称乙脑)减毒株病毒接种于原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液，加入适宜稳定剂后冻干制成。用于预防乙型脑炎。
1 基本要求
生产和检定用没施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。
2 制造
2.1 生产用细胞
生产用细胞为原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞。
2.1．l细胞管理及检定
应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
2.1.2 细胞制备
选用10～14日龄地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，置37℃±1℃培养。细胞生长成致密单层后接种病毒。
2.2 毒种
2.2.1 名称及来源
生产用毒种为乙脑病毒SAl4-14-2减毒株。
2.2.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。
原始种子批传代应不超过第6代，主种子批应不超过第8代，工作种子批应不超过第9代，生产的疫苗应不超过第10代。
2.2.3 种子批毒种的检定
主种子批应进行以下全面检定。工作种子批应至少进行2.2.3.1～2.2.3.4项检定。
2.2.3.1 鉴别试验
毒种批与非同源性乙恼特异性抗体混合，置37℃水浴90分钟，接种地鼠肾单层细胞或BHK〈［21］〉细胞进行中和试验，观察5～7天判定结果。中和指数应大于1000。
2.2.3.2 病毒滴定
取毒种做10倍系列稀释，至少取3个稀释度的病毒液，分别接种BHK〈［21］〉细胞，用蚀斑法进行滴定。冻干种子批病毒滴度应不低于5.7 lg PFU/ml；液体种子批病毒滴度应不低于7.2 1g PFU/ml。
2.2.3.3 无菌检查
依法检查(附录ⅫA)，应符合规定。
2.2.3.4支原体检查
依法检查(附录ⅫB)，应符合规定。
2.2.3.5 病毒外源因子检查
依法检查(附录ⅫC)．应符合规定。
2.2.3.6 E蛋白基因稳定性试验
以E蛋白基因区核苷酸序列测定验证其遗传稳定性。编码E蛋白基因区的8个关键位点氨基酸不能发生改变(E-107：苯丙氨酸，E-138：赖氨酸，E-176：缬氨酸，E-177：丙氨酸，E-264：绀氨酸，E-279：蛋氨酸，E-315：缬氨酸，E-439：精氨酸)。
与基因库中登录号为D90195的乙型脑炎减毒株SA14-14-2株的E蛋白基因区核苷酸序列的同源性不低于99.6％。
2.2.3.7 免疫原性检查
用主种子批毒种制备原疫苗，取lO〈-3〉、10〈-4〉、10〈-5〉至少3个稀释度，分别免疫体重为10～12g小鼠10只，每只皮下注射0.1ml，免疫1次。免疫后14天用P〈［3］〉株乙脑强毒腹腔攻击，每只注射0.3m1，其病毒量应不低于500腹腔滴定的LD〈［50］〉。同时每只小鼠脑内接种稀释液0.03ml。攻击后14天判定结果，ED〈［50］〉应不高于3.0 lg PFU，攻击对照组小鼠死亡率应不低于80％。
2.2.3.8 猴体神经毒力试验
用病毒滴度不低于5.7 lg PFU/ml的冻干主种子批进行猴体神经毒力试验。将主种子批毒种作1：5稀释，分别注射10只恒河猴的两侧丘脑各O．5ml和腰部脊髓内0.2ml。对照组用强毒SA〈［l4］〉株稀释成10〈2〉PFU/ml和10〈3〉PFU／ml病毒量，以同法接种恒河猴，每个稀释度注射4只恒河猴。
对SAl4一14-2减毒组的10只恒河猴观察至少18天，应无任何临床症状，组织学检查仅表现为注射部位、脑和脊髓有轻微的炎症反应。而对照组SA〈［14］〉株在注射后8天内病毒量10〈3〉PFU／m1组4只恒河猴应全部死亡；病毒量为10〈2〉PFU／ml组的4只恒河猴，至少应有2只死亡。组织学检查表现主要特征为神经细胞坏死，较少炎症反应。
2.2.3.9 脑内致病力试验
用种子批毒种接种体重为l2～14g小鼠．至少10只，每只脑内注射0.03ml，观察1 4天应存活。接种后3天内死亡者不计，但3天内死亡数不得超过20％。3天后如有小鼠发病，应处死后取脑，测定致病力。小鼠脑内毒力应不高于3.0 1g LD〈［50］〉/0.03ml，同时以10〈-1〉病鼠脑悬液皮下注射体重为10～1 2g小鼠10只，每只0.1m1，观察14天，应全部健存。
2.2.3.10 皮下感染人脑试验
用种子批毒种接种体重为10～1 2g小鼠10只．每只皮下注射0.1ml，同时右侧脑内空刺，观察14天．应全部健存。
2.2.3.11 乳鼠传代返祖试验
用病毒滴度不低于7.2 1g PFU／ml(液体毒种)或不低于5.7 lg PFU/ml(冻干毒种)的种子批毒种接种3～5日龄乳鼠lO只，每只脑内注射O．02ml。将发病的乳鼠处死3只，解剖取脑，用体重为l2～14g小鼠测其致病力，脑内毒力应不高于3．o lg LD〈［50］〉/0.03ml，同时以10〈-1〉的发病乳鼠脑悬液皮下注射体重为10～l2g小鼠lO只，每只0.1ml，观察14天，应全部键存。
2.2.4 毒种保存
应置一60℃以下保存。
2.3 原液
2.3.1 细胞制备
同2.1.2项。
2.3.2 培养液
培养液为含适量灭能小牛血清和乳蛋白水解物的Earle’s液或其他适宜培养液。用于细胞培养的小牛血清应为乙脑抗体阴性。小牛血清的质量应符合要求(附录ⅩⅢD)。
2.3.3 对照细胞病毒外源因子检查
依法检查(附录ⅫC)，应符合规定。
2.3.4 病毒接种和培养
挑选生长致密单层的细胞。用洗涤液充分冲洗后加适量维持液，按0.001MOI(或维持液内的病毒滴度为2.7～3.7 lg PFU/ml)接种病毒，置36℃±1℃培养。
2.3.5 病毒收获
种毒后72小时左右细胞出现病变时收获病毒液。可根据细胞情况，换加维持液继续培养，多次收获病毒液。
2.3.6 单次病毒收获液合并
合并多次病毒收获液，澄清过滤，即为原液。
2.3.7 原液检定
按3.1项进行。
2.4 半成品
2.4.1 配制
检定合格的原液加适量稳定剂即为半成品，每批量不得超过150L。
2.4.2 半成品检定
按3.2项进行。
2.5 成品
2.5.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.5.2 分装及冻干
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。分装过程中疫苗半成品应置冰浴中。
2.5.3 规格
按标示量复溶后每瓶0.5ml、2.5ml。每1次人用剂量为0.5ml，含乙型脑炎活病毒应不低于5.4 lg PFU。
2.5．l包装
应符合“生物制品包装规程”规定。
3 检定
3.1 原液检定
3.1.1 病毒滴定
按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于7.01g PFu／ml。
3.1.2 无菌检查
依法检查(附录ⅫA)，应符合规定。
3.1.3 支原体检查
依法检查(附录ⅫB)，应符合规定。
3.1.4 逆转录酶活性检查
依法检查(附录ⅨM)，应为阴性。
3.2 半成品检定
3.2.1 病毒滴定
按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于6.8 lg PFU/m1。
3.2.2 无菌检查
依法检查(附录ⅫA)，应符合规定。
3.3 成品检定
除水分测定外，按标示量加入灭菌PBS，复溶后进行以下各项检定。
3.3.1 鉴别试验
按2.2.3.1项进行。
3.3.2 外观
应为淡黄色疏松体，复溶后为橘红色或淡粉红色澄明液体，无异物。
3.3.3 水分
应不高于3．O％(附录ⅦD)。
3.3.4 病毒滴定
按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于5.7 lg PFU/ml。
3.3.5 热稳定性试验
疫苗出厂前应进行热稳定性试验，应与病毒滴定同时进行。于37℃放置7天，按2.2.3.2项进行，病毒滴度应不低于5.7 lg PFU／m1，病毒滴度下降应不高于1.0 1g PFU/ml。
3.3.6 牛血清白蛋白残留量
采用酶联免疫法，牛血清白蛋白残留量应不高于50ng/剂。
3.3.7安全试验
3.3.7.1 脑内致病力试验
同2.2.3.9项。
3.3.7.2 乳鼠传代返祖试验
同2.2.3.1l项。
3.3.8 无菌检查
依法检查(附录ⅫA)，应符合规定。
3.3.9 异常毒性检查
依法检查(附录ⅫF)，应符合规定。
3.1 疫苗稀释剂检定
疫苗稀释剂为灭菌PBS。
3.4.1 pH值
应为7.2～8．O(附录V A)。
3.4.2无菌检查
依法检查(附录ⅫA)，应符合规定。
4 保存、运输及有效期
于8℃以下避光保存和运输。自病毒滴度检定合格之日起，有效期为1年6个月。
5 使用说明
乙型脑炎减毒活疫苗使用说明
【药品名称】
通用名称：乙型脑炎减毒活疫苗
英文名称：Japanese Encephalitis Vaccine，Live
汉语拼音：Yixing Naoyan Jiandu Huoyimiao
【成分和性状】本品系用流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2减毒株接种原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液，加适宜稳定剂冻干制成。为淡黄色疏松体，复溶后为橘红色或淡粉红色澄明液体。
【接种对象】8月龄以上健康儿童及由非疫区进入疫区的儿童和成人。
【作用与用途】接种本疫苗后，可刺激机体产生抗乙型脑炎病毒的免疫力。用于预防流行性乙型脑炎。
【规格】复溶后每瓶0.5ml、2.5ml。每1次人用剂量为0.5ml，含乙型脑炎活病毒应不低于5.4 1g PFU。
【用法用量】(1)按标示量加入疫苗稀释剂，待完全复溶后使用。
(2)于上臂外侧三角肌下缘附着处皮下注射。
(3)8月龄儿童首次注射0.5ml；分别于2岁和7岁再各注射0.5ml，以后不再免疫。
【不良反应】少数儿童可能出现一过性发热反应，一般不超过2天，可自行缓解。偶有散在皮疹出现， 一般不需特殊处理，必要时可对症治疗。
【禁忌】(1)发热，患急性传染病、中耳炎、活动性结核或心脏、肾脏及肝脏等疾病者。
(2)体质衰弱、有过敏史或癫痢史者。
(3)先天性免疫缺陷者，近期或正在进行免疫抑制剂治疗者。
(4)妊娠期妇女。
【注意事项】(1)注射疫苗过程中，切勿使消毒剂接触疫苗。
(2)疫苗复溶后有摇不散的块状物、复溶前疫苗变红、疫苗瓶有裂纹或瓶塞松动者，均不得使用。
(3)疫苗复溶后如不能立即用完，应放置在2～8℃并在1小时内用完，剩余的疫苗应废弃。
【贮藏】于8℃以下避光保存和运输。
【包装】
【有效期】1年6个月。
【执行标准】
【批准文号】
【生产企业】
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