拼音名：Yixing Naoyan Miehuoyimiao
英文名：Japanese Encephalitis Vaccine，InactiVated
书页号：2005年版三部- 74
本品系用乙型脑炎(简称乙脑)病毒接种原代地鼠肾细胞，经培养、收获病毒液、灭活病毒后制成。用于预防乙型脑炎。
l 基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”有关要求。
2 制造
2.1 生产用细胞
生产用细胞为原代地鼠肾细胞或连续传代不超过5代的地鼠肾细胞。
2.1.1 细胞管理及检定
应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
2.1.2 细胞制备
选用2周龄左右地鼠，无菌取肾，剪碎，经胰蛋白酶消化，用培养液分散细胞，制备细胞悬液，分装培养瓶，于37℃培养。
2.2 毒种
2.2.1 名称及来源
生产用毒种为乙脑病毒P〈［3］〉株。
2.2.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”规定。
脑内接种小鼠或乳鼠制备主种子批和工作种子批。原始种子批传代应不超过第53代，主种子批应不超过第68代，工作种子批应不超过第69代。
2.2.3 种子批毒种的检定
主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1～2.2.3.4项检定。
2.2.3.1 鉴别试验
毒种与相应的特异性血清等量混合，置37℃水浴90分钟，进行小鼠脑内中和试验，检定病毒的特异性，中和指数应大于500。
2.2.3.2 病毒滴定
用体重为7～9g小鼠进行脑内滴定，滴度应不低于9.0lg LD〈［50］〉/ml。
2.2.3.3 无菌检查
依法检查(附录ⅫA)，应符合规定。
2.2.3.4 支原体检查
依法检查(附录ⅫB)，应符合规定。
2.2.3.5 病毒外源因子检查
依法检查(附录ⅫC)，应符合规定。
2.2.3.6 免疫原性检查
用主种子批毒种制备原疫苗，腹腔免疫体重为12～14g小鼠10只，每只0.3 ml，免疫2次，间隔3天，于初免第10～14天，用不低于10 000LD〈［50］〉病毒量的非生产用乙脑病毒P〈［3］〉株进行腹腔攻击，同时每只脑腔注射0.03ml稀释液。对照组死亡率应不低于80％，免疫组应100％保护。
2.2.4 毒种保存
毒种应置-60℃以下保存；液体工作种子批于-60℃保存时间应不超过1年。
2.3 原液
2.3.1 细胞制备
同2.1.2项。
2.3.2 培养液
培养液为含适量灭能小牛血清和乳蛋白水解物的Earle’s液或其他适宜培养液。用于细胞培养的小牛血清应为乙脑抗体阴性。小牛血清的质量应符合要求(附录ⅫD)。
2.3.3 对照细胞病毒外源因子检查
依法检查(附录ⅫC)，应符合规定。
2.3.4 病毒接种和培养
挑选生长致密单层细胞，弃去培养液，用PBS充分冲洗细胞，去除小牛血清后，加适量维持液，接种病毒，在适宜温度下培养。
2.3.5 病毒收获
选择有典型细胞病变的培养物，澄清过滤至大容器中，使其成均一病毒液，再经过澄清膜过滤或连续流离心。可根据细胞情况，换加维持液继续培养，多次收获病毒液，收获物即为病毒收获液。
2.3.6 病毒收获液检定
按3.1项进行。
2.3.7 病毒灭活
按1：2000的比例加入甲醛溶液，置适宜温度下一定时间灭活病毒，即为原液。可加入硫柳汞，终浓度应不高于0.10mg／m1。
2.3.8 原液检定
按3.2项进行。
2.4 半成品
2.4.1 配制
无菌检查合格的原液合并后即为半成品。
2.4.2 半成品检定
按3.3项进行。
2.5 成品
2.5.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.5.2 分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.5.3 规格
每瓶2.0ml、5.0ml、10ml。每1次人用剂量为0.5ml。
2.5.4 包装
应符合“生物制品包装规程”规定。
3 检定
3.1 病毒收获液检定
3.1.1 病毒滴定
自不超过150L病毒收获液中取样进行病毒滴定。将病毒收获液10倍系列稀释，取至少3个稀释度，每个稀释度脑内接种体重为7～9g小鼠4只，每只0.03ml，逐日观察，3日内死亡者不计，观察14天，滴度应不低于7.5 1g LD〈［50］〉/ml。
3.1.2 无菌检查
依法检查(附录ⅫA)，应符合规定。
3.1.3 支原体检查
依法检查(附录ⅫB)，应符合规定。
3.2 原液检定
3.2.1 无菌检查
依法检查(附录ⅫA)，应符合规定。
3.2.2 病毒灭活验证试验
自不超过150L原液中取样进行病毒灭活验证试验。取原液脑内接种体重为12～14g小鼠8只，每只0.03ml，同时腹腔接种0.5ml，为第1代；7天后将第1代小鼠处死3只，取脑制成10％悬液，脑内接种6只小鼠，为第2代；7天后将第2代小鼠处死3只，同法接种6只小鼠，为第3代。从接种之日起逐日观察14天，每代小鼠除处死和接种后3日内非特异性死亡外，全部健存为合格。
若传代3日后有个别小鼠死亡，应立即取鼠脑制成悬液再接种3只小鼠，观察14天，小鼠均健存仍判合格。如仍有小鼠死亡，则应复试，复试合格后仍可使用。复试后仍有小鼠死亡该批原液应予废弃。
3.3 半成品检定
无菌检查
依法检查(附录ⅫA)，应符合规定。
3.4 成品检定
3.4.1 鉴别试验
按3.4.4项进行，应符合规定。效价测定不合格，鉴别试验不成立。
3.4.2 外观
应为橘红色澄明液体，无异物，无沉淀。
3.4.3 化学检定
3.4.3.1 pH值
应为7.2～8.0(附录V A)。
3.4.3.2 游离甲醛含量
应不高于0.50mg/ml(附录Vl L)。
3.4.3.3 硫柳汞含量
应不高于0.10mg/ml(附录ⅦB)。
3.4.4 效价测定
采用免疫小鼠中和抗体测定法。每批效价测定用本品代表的原液量不得超过1000L。以蚀斑减少中和试验测定中和抗体。参考疫苗(RA和RB)及中和试验阳性血清由国家药品检定机构提供。
将被检疫苗(T)和参考疫苗(R)分别稀释成1：32，腹腔免疫体重为12～14g小鼠10只，每只0.5ml，免疫2次，问隔7大。第2次免疫后第7天采血，分离血清，同组血清等量混合，于56℃灭活30分钟。稀释阳性血清、被检疫苗血清和参考疫苗血清，分别与稀释病毒(约200PFU/0.4m1)等量混合，同时将稀释后的病毒与正常小鼠血清等量混合，作为病毒对照，置37℃水浴90分钟，接种6孔板BHK〈［21］〉细胞，每孔O．4m1，置37℃培养90分钟，加入含甲基纤维素的培养基覆盖物，于37℃ 5％二氧化碳孵箱中培养5天，染色，蚀斑计数，计算被检疫苗和参考疫苗组对病毒对照组的蚀斑减少率。病毒对照组的蚀斑平均数应在50～150之间。
判定标准如下：
(1)合格：T≥(RA+RB)/2－0.33
(2)重试：
(RA+RB)／2－0.66＜T＜(RA+RB)/2－0.33
(3)不合格：T＜(RA+RB)/2－0.66
3.4.5 热稳定性试验
疫苗出厂前应进行热稳定性试验。于37℃放置7天，按3.4.4项进行效价测定。如合格，视为效价测定合格。
3.4.6 牛血清白蛋白残留量
采用酶联免疫法，牛血清白蛋白残留量应不高于50ng／剂。
3.4.7 无菌检查
依法检查(附录ⅫA)，应符合规定。
3.4.8 异常毒性检查
依法检查(附录ⅫF)，应符合规定。
3.4.9 细菌内毒素检查
应不高于100EU/剂(附录ⅫE凝胶限量试验)。
3.5 亚硫酸氢钠溶液检定
3.5.1 亚硫酸氢钠含量
浓度应为15％～25％(附录ⅦE)。
3.5.2 无毒性验证试验
按使用浓度稀释本品，腹腔注射体重为18～20g小鼠5只，每只0.5ml，观察7天，应全部健存。
4 保存、运输及有效期
于2～8℃避光保存和运输。自效价测定合格之日起。有效期为2年。
5 使用说明
乙型脑炎灭活疫苗使用说明
【药品名称】
通用名称：乙型脑炎灭活疫苗
英文名称：Japanese Encephalitis Vaccine，Inactivated
汉语拼音：Yixing Naoyan Miehuoyimiao
【成分和性状】本品系用乙脑病毒接种地鼠肾细胞，经培养、收获、灭活病毒后制成。为橘红色澄明液体，含硫柳汞防腐剂。
【接种对象】6月龄～10周岁儿童和由非疫区进入疫区的儿童和成人。
【作用与用途】接种本疫苗后，可刺激机体产生抗乙型脑炎病毒的免疫力。用于预防流行性乙型脑炎。
【规格】每瓶2.0ml、5.0ml、10ml。每1次人用剂量为0.5ml。
【用法用量】(1)为减轻疼痛，注射前在疫苗中加入适量亚硫酸氢钠溶液，疫苗由红色变为黄色，即可注射。
(2)于上臂外侧三角肌下缘附着处皮下注射。
(3)免疫程序如下：6～12月龄接种第1针和第2针，时间间隔7～10天，第2针6个月后和4～10岁时分别接种第3针和第4针。每1次注射剂量为0.5ml。
【不良反应】注射后一般无不良反应，个别出现头晕和一过性发热反应，一般不超过2天，可自行缓解。偶有散在皮疹出现，一般不需特殊处理，必要时可对症治疗。
【禁忌】(1)发热，患急性疾病、严重慢性疾病或体质衰弱者。
(2)对药物或食物有过敏史者。
(3)有惊厥史者。
【注意事项】(1)疫苗浑浊、变色、有异物或疫曲瓶有裂纹者，均不得使用。
(2)应备有肾上腺素等药物，以备偶有发生严重过敏反应时急救用。接受注射者在注射后应在现场休息片刻。
(3)严禁冻结。
【贮藏】于2～8℃避光保存和运输。
【包装】
【有效期】2年。
【执行标准】
【批准文号】
【生产企业】
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