拼音名：Zhusheyong Chongzu Lianjimei
英文名：Recombinant Streptokinase for Injection
书页号：2005年版三部－238
本品系由含有高效表达链激酶基因的大肠杆菌，经发酵、分离和高度纯化后冻干制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
1 基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造
2.1 工程菌菌种
2.1.1 名称及来源
重组链激酶工程菌株系由带有链激酶基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。
2.1.2 种子批的建立
应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规程”的规定。
2.1.3 菌种检定
主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。
2.1.3.1 划种LB琼脂平板
应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。
2.1.3.2 染色镜检
应为典型的革兰阴性杆菌。
2.1.3.3 对抗生素的抗性
应与原始菌种相符。
2.1.3.4 电镜检查(工作种子批可免做)
应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。
2.1.3.5 生化反应
应符合大肠杆菌生物学性状。
2.1.3.6 链激酶表达量
在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。
2.1.3.7 质粒检查
该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。
2.2 原液
2.2.1 种子液制备
将检定合格的工作种子批菌种接种于适宜的培养基(可含适量抗生素)中培养，供发酵罐接种用。
2.2.2 发酵用培养基
采用适宜的不含任何抗生素的培养基。
2.2.3 种子液接种及发酵培养
2.2.3.1 在灭菌培养基中接种适量种子液。
2.2.3.2 在适宜的温度下进行发酵，应根据经批准的发酵工艺进行，并确定相应的发酵条件，如温度、pH值、溶氧、补料、发酵时间等。发酵液应定期进行质粒丢失率检查(附录Ⅸ G)。
2.2.4 发酵液处理
用适宜的方法收集处理菌体。
2.2.5 初步纯化
采用经批准的纯化工艺进行初步纯化，使其纯度达到规定的要求。
2.2.6 高度纯化
经初步纯化后，采用经批准的工艺进行高度纯化，使其达到3.1项要求，即为链激酶原液。加入适宜稳定剂除菌过滤后，保存于适宜温度，并规定其有效期。
2.2.7 原液检定
按3.1项进行。
2.3 半成品
2.3.1 配制与除菌
2.3.1.1 稀释液配制
按经批准的配方配制稀释液。配制后应立即用于稀释。
2.3.1.2 稀释与除菌
将检定合格加稳定剂的链激酶原液用2.3.1.1项稀释液稀释至所需浓度。除菌过滤后即为半成品，保存于2～8℃。
2.3.2 半成品检定
按3.2项进行。
2.4 成品
2.4.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装及冻干
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.4.3 规格
应为经批准的规格。
2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”规定。
3 检定
3.1 原液检定
3.1.1 生物学活性
依法测定(附录Ⅹ I)。
3.1.2 蛋白质含量
依法测定(附录Ⅵ B第二法)。
3.1.3 比活性
为生物学活性与蛋白质含量之比，每1mg蛋白质应不低于9.00×10〈4〉IU。
3.1.4 纯度
3.1.4.1 电泳法
依法测定(附录Ⅳ C)。用非还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为10%，加样量应不低于10μg，用考马斯亮蓝R250染色。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。
3.1.4.2 高效液相色谱法
依法测定(附录Ⅲ B)。色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以A相(三氟乙酸-水溶液：取1.0ml三氟乙酸加水至1000ml，充分混匀)、B相(三氟乙酸-乙腈溶液：取1.0ml三氟乙酸加入色谱纯乙腈至1000ml，充分混匀)为流动相，在室温条件下，进行梯度洗脱(0～70%B相)。上样量不低于10μg，于波长280nm处检测，以链激酶色谱峰计算理论板数应不低于2000。按面积归一化法计算。链激酶主峰面积应不低于总面积的95.0%。
3.1.5 分子量
依法测定(附录Ⅳ C)。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶胶浓度为10%，加样量应不低于1.0μg，制品的分子质量应为47.0kD±4.70kD。
3.1.6 外源性DNA残留量
每1次人用剂量应不高于10ng(附录Ⅸ B)。
3.1.7 宿主菌蛋白残留量
应不高于总蛋白质的0.050%(附录Ⅸ C)。
3.1.8 残余抗生素活性
依法测定(附录Ⅸ A)，不应有残余氨苄西林或其他抗生素活性。
3.1. 9 细菌内毒素检查
每1mg蛋白质应小于3EU(附录Ⅻ E凝胶限量试验)。
3.1.10 等电点
主区带应为4.6～5.6(附录Ⅳ D)。
3.1.11 紫外光谱扫描
最大吸收峰波长应为277nm±3nm(附录Ⅱ A)。
3.1.12 肽图(至少每半年测定1次)
依法测定(附录Ⅷ E)，应与对照品图形一致。
3.1.13 N-末端氨基酸序列(至少每年测定1次)
用氨基酸序列分析仪测定，N-末端序列应为：
Val-Lys-Pro-Val-Gln-Ala-Ile-Ala-Gly-Ser-Glu-Trp-Leu-Leu-Asp。
3.2 半成品检定
3.2.1 细菌内毒素检查
每1mg蛋白质应小于3EU(附录Ⅻ E凝胶限量试验)。
3.2.2 无菌检查
依法检查(附录Ⅻ A)，应符合规定。
3.3 成品检定
除水分测定外，应按标示量加入灭菌注射用水，复溶后进行其余各项检定。
3.3.1 鉴别试验
按免疫印迹法(附录Ⅷ A)或免疫斑点法(附录Ⅷ B)测定，应为阳性。
3.3.2 物理检查
3.3.2.1 外观
应为白色或微黄色疏松体，加入标示量注射用水后应迅速复溶为澄明液体。
3.3.2.2 可见异物
依法检查(附录Ⅴ B)，应符合规定。
3.3.2.3 装量差异
按附录Ⅰ A中装量差异项进行，应符合规定。
3.3.3 化学检定
3.3.3.1 水分
应不高于3.0%(附录Ⅶ D)。
3.3.3.2 pH值
应为6.9～7.9(附录Ⅴ A)。
3.3.4 生物学活性
应为标示量的80%～150%(附录Ⅹ I)。
3.3.5 无菌检查
依法检查(附录Ⅻ A)，应符合规定。
3.3.6 细菌内毒素检查
每1次人用剂量应小于15EU(附录Ⅻ E凝胶限量试验)。
3.3.7 异常毒性检查
依法检查(附录Ⅻ F小鼠试验法)，应符合规定。
4 保存、运输及有效期
于2～8℃避光保存和运输。自分装之日起，按批准的有效期执行。
5 使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定。
