拼音名：Chongzu Ren Cuhongsu Zhusheye (CHO Xibao)
英文名：Recombinant Human Erythropoietin Injection (CHO Cell)
书页号：2005年版三部－232
本品系由含有高效表达人红细胞生成素(简称人促红素)基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，经细胞培养、分离和高度纯化后制成。含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素。
1 基本要求
生产和检定用设施、原料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。
2 制造
2.1 工程细胞
2.1. 1 名称及来源
重组人促红素工程细胞系由带有人促红素基因的重组质粒转染的CHO-dhfr-(二氢叶酸还原酶基因缺陷型细胞)细胞系。
2.1.2 细胞库建立、传代及保存
由原始细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为主细胞库；从主细胞库的细胞传代，扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。每次传代不超过经批准的代次。细胞系冻存于液氮中，检定合格后方可用于生产。
2.1.3 主细胞库及工作细胞库细胞的检定
应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
2.1.3.1 外源因子检查
细菌和真菌、支原体、病毒检查均应为阴性。
2.1.3.2 细胞鉴别试验
应用同工酶分析、生物化学、免疫学、细胞学和遗传标记物等任一方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。
2.1.3.3 人促红素表达量
应不低于原始细胞库细胞表达量。
2.2 原液
2.2.1 细胞的复苏与扩增
从工作细胞库来源的细胞复苏后，于含灭能小牛血清培养液中进行传代、扩增，供转瓶或细胞培养罐接种用。小牛血清的质量应符合规定(附录XIII D)。
2.2.2 细胞培养液
生产用细胞培养液应不含牛血清和任何抗生素。
2.2.3 细胞培养
细胞培养全过程应严格按照无菌操作。细胞培养时间可根据细胞生长情况而定。
2.2.4 分离纯化
收集的培养液按经批准的纯化工艺进行，采用经批准的超滤法或其他适宜方法进行浓缩，多步色谱纯化后制得高纯度的重组人促红素，即为人促红素原液，除菌过滤后保存于适宜温度，并规定其有效期。
2.2.5 原液检定
按3.1项进行。
2.3 半成品
2.3.1 配制与除菌
原液加入适宜稳定剂，并用缓冲液稀释。除菌过滤后即为半成品。
2.3.2 半成品检定
按3.2项进行。
2.4 成品
2.4.1 分批
应符合“生物制品分批规程”规定。
2.4.2 分装
应符合“生物制品分装和冻干规程”规定。
2.4.3 规格
应为经批准的规格。
2.4.4 包装
应符合“生物制品包装规程”规定。
3 检定
3.1 原液检定
3.1.1 蛋白质含量
依法测定(附录Ⅵ B第二法)。
3.1.2 生物学活性
3.1.2.1 体内法
依法测定(附录Ⅹ B)。
3.1.2.2 体外法
按酶联免疫法试剂盒说明书测定。
3.1.3 比活性
每1mg蛋白质应不低于1.2×10〈5〉IU。
3.1.4 纯度
3.1.4.1 电泳法
依法测定(附录Ⅳ C)。用非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于10μg，经扫描仪扫描，纯度应不低于98.0%。
3.1.4.2 高效液相色谱法
依法测定(附录Ⅲ B)。亲水硅胶体积排阻色谱柱，排阻极限300kD，孔径24nm，粒度10μm，直径7.5mm，长30cm；流动相为3.2mmol/L磷酸氢二钠-1.5mmol/L磷酸二氢钾-400.4mmol/L氯化钠，pH7.3；上样量20～100μg，于波长280nm处检测，以人促红素色谱峰计算理论板数应不低于1500。按面积归一化法计算人促红素纯度，应不低于98.0%。
3.1.5 分子量
依法测定(附录Ⅳ C)。用还原型SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，考马斯亮蓝R250染色，分离胶胶浓度为12.5%，加样量应不低于1μg，分子质量应为36～45kD。
3.1.6 紫外光谱扫描
依法测定(附录Ⅱ A)，其最大吸收峰279nm±2nm；最小吸收峰250nm±2nm；在320～360nm处无吸收峰。
3.1.7 等电点
依法测定(附录Ⅳ D)，使用pH值为3.0～5.0的两性电解质，等电点应为pH3.3～4.3。
3.1.8 唾液酸含量
每1mol人促红素应不低于9.0mol(附录Ⅵ C)。
3.1.9 外源性DNA残留量
每10 000IU人促红素应不高于100pg(附录Ⅸ B)。
3.1.10 CHO细胞蛋白残留量
用双抗体夹心酶联免疫法检测，应不高于0.10%。
3.1.11 细菌内毒素检查
每10 000IU人促红素应小于2EU(附录Ⅻ E凝胶限量试验)。
3.1.12 牛血清白蛋白残留量
用酶联免疫检测，应不高于0.01%。
3.1.13 肽图(至少每半年测定1次)
供试品经透析、冻干后，用1%碳酸氢铵溶液溶解并稀释至1.5mg/ml，依法测定(附录Ⅷ E)，其中加入胰蛋白酶(序列分析纯)，37℃±0.5℃保温6小时，色谱柱为反相C8柱(25cm×4.6mm，粒度5μm，孔径30nm)，柱温为45℃±0.5℃；流速为0.75ml/分钟；进样量为20μl；按下表进行梯度洗脱(表中A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙酸-80%乙腈水溶液)。┏━━━━┳━━━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┳━━━━━┓┃ 编号 ┃ 时间/分钟 ┃ 流速/ml ┃ A% ┃ B% ┃┣━━━━╋━━━━━━━╋━━━━━╋━━━━━╋━━━━━┫┃ 1 ┃ 0.00 ┃ 0.75 ┃ 100.0 ┃ 0.0 ┃┃ 2 ┃ 30.00 ┃ 0.75 ┃ 85.0 ┃ 15.0 ┃┃ 3 ┃ 75.00 ┃ 0.75 ┃ 65.0 ┃ 35.0 ┃┃ 4 ┃ 115.00 ┃ 0.75 ┃ 15.0 ┃ 85.0 ┃┃ 5 ┃ 120.00 ┃ 0.75 ┃ 0.0 ┃ 100.0 ┃┃ 6 ┃ 125.00 ┃ 0.75 ┃ 100.0 ┃ 0.0 ┃┃ 7 ┃ 145.00 ┃ 0.75 ┃ 100.0 ┃ 0.0 ┃┗━━━━┻━━━━━━━┻━━━━━┻━━━━━┻━━━━━┛
肽图应与人促红素对照品一致。
3.1.14 N-末端氨基酸序列(至少每年测定1次)
用氨基酸序列分析仪测定。N-末端序列应为：
Ala-Pro-Pro-Arg-Leu-Ile-Cys-Asp-Ser-Arg-Val-Leu-Glu-Arg-Tyr。
3.2 半成品检定
3.2.1 细菌内毒素检查
每1000IU人促红素应小于2EU(附录Ⅻ E凝胶限量试验)。
3.2.2 无菌检查
依法检查(附录Ⅻ A)，应符合规定。
3.3 成品检定
3.3.1 鉴别试验
按免疫印迹法(附录Ⅷ A)或免疫斑点法(附录Ⅷ B)测定，应为阳性。
3.3.2 物理检查
3.3.2.1 外观
应为无色澄明液体。
3.3.2.2 可见异物
依法检查(附录Ⅴ B)，应符合规定。
3.3.2.3 装量
按附录Ⅰ A中装量项进行，应不低于标示量。
3.3.3 化学检定
3.3.3.1 pH值
应为6.4～7.4或5.4～6.4(附录Ⅴ A)。
3.3.3.2 钠离子含量
应不大于190mmol/L(附录Ⅶ J)。
3.3.3.3 枸橼酸离子含量
应不大于25mmol/L(附录Ⅶ H第二法)。
3.3.3.4 蛋白质含量
依法测定(附录Ⅵ B第二法)，应符合经批准的蛋白质含量范围。
3.3.4 生物学活性
3.3.4.1 体外法
按酶联免疫法试剂盒说明书测定供试品体外活性(IU/ml)，根据标示装量计算供试品生物学活性(IU/瓶)，应为标示量的80%～120%。
3.3.4.2 体内法
按附录Ⅹ B测定供试品体内活性(IU/ml)，根据标示装量计算供试品生物学活性(IU/瓶)，应为标示量的80%～140%。
3.3.5 无菌检查
依法检查(附录Ⅻ A)，应符合规定。
3.3.6 细菌内毒素检查
每10001U人促红素应小于2EU(附录Ⅻ E凝胶限量试验)。
3.3.7 异常毒性检查
依法检查(附录Ⅻ F小鼠试验法)，应符合规定。
4 保存、运输及有效期
于2～8℃避光保存和运输。自分装之日起，按批准的有效期执行。
5 使用说明
应符合“生物制品包装规程”规定。
