药典2000版-重组人胰岛素

时间：2009-10-28 |来源：三九中医药网 收集整理|点击：次


    拼音名：Chongzu Ren Yidaosu
    英文名：Recombinant Human Insulin
    书页号：2000年版二部-497　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　C257H338N65O77S6　 5807.69
　　本品为重组DNA技术生产的由51个氨基酸残基组成的蛋白质，宿主细胞为大肠杆菌。按干燥品计算，每1mg含重组人胰岛素不得少于27.5单位。
　　重组人胰岛素中残余宿主DNA和宿主细胞蛋白质为与生产过程相关的、潜在的特异性杂质，必须在生产过程中严格控制，其限度应符合有关规定。

    【性状】本品为白色或类白色的结晶性粉末。
　　本品在水、乙醇和乙醚中几乎不溶，在稀盐酸和稀氢氧化钠溶液中易溶。

    【鉴别】 (1)在效价测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与重组人胰岛素对照品峰的保留时间一致。
　　(2)取本品适量，用0.1％三氟醋酸溶液制成每1ml中含10mg的溶液，取20μl，加0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(pH7.3)20μl、0.1％V8酶溶液20μl与水140μl，混匀，置37℃水浴中2小时后，加磷酸3μl，作为供试品溶液；另取重组人胰岛素对照品适量，同法制备，作为对照品溶液。照效价测定项下的方法，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(90：10)为流动相A，乙腈-水(50：50)为流动相B，进行梯度洗脱。
　　　　　　　　　　 时间　　　　　　 流动相A　　　　　　　流动相B　　　　　　　　　　 0分　　　　　　　　90％　　　　　　　　 10％　　　　　　　　　　 5分　　　　　　　　80％　　　　　　　　 20％　　　　　　　　　　45分　　　　　　　　40％　　　　　　　　 60％　　　　　　　　　　50分　　　　　　　　40％　　　　　　　　 60％　　取对照品溶液和供试品溶液各25μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品的肽图谱应与对照品的肽图谱一致。

    【检查】有关物质　取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含3.5mg的溶液，作为供试品溶液。照效价测定项下的方法，以0.2mol/L硫酸盐缓冲液(pH2.3)-乙腈(82：18)为流动相A，乙腈-水(50：50)为流动相B，进行梯度洗脱。
　　　　　　　　　　时间　　　　　　　流动相A　　　　　　　流功相B　　　　　　　　　　0分　　　　　　　　78％　　　　　　　　　22％　　　　　　　　　 36分　　　　　　　　78％　　　　　　　　　22％　　　　　　　　　 61分　　　　　　　　33％　　　　　　　　　67％　　　　　　　　　 67分　　　　　　　　33％　　　　　　　　　67％　　调节流动相比例使重组人胰岛素主峰的保留时间约为25分钟，系统适用性试验应符合效价测定项下的规定。取供试品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按面积归一化法计算，总有关物质不得过3.0％。
　　高分子蛋白质　取本品适量，用溶解液(取乙二胺四醋酸四钠300mg，加水250ml溶解后，加0.1mol/L盐酸溶液3ml，加水至500ml)制成每1ml中含1mg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用稀释液(取乙二胺四醋酸四钠600mg，加水900ml溶解后，用1mol/L盐酸溶液调节pH值至8.5，加水至1000ml)稀释成每1ml中含0.01mg的溶液，作为对照溶液。照高效液相色谱法(附录Ⅴ D)测定，以适合分离分子量为5000～60000球状蛋白的色谱用亲水硅胶为填充剂；0.4mol/L碳酸氢铵溶液-乙腈(69：31)为流动相；流速为每分钟0.5ml；检测波长为214nm。取人胰岛素单体-二聚体对照品，用乙二胺四醋酸溶解制成每1ml中含1mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，以人胰岛素单体和二聚体之间的峰谷高与二聚体峰高之比作为分离度，分离度应不大于0.6。取供试品溶液和对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中显示的所有分子量大于重组人胰岛素单体的各峰面积之和，应不得大于对照溶液主峰的峰面积(1.0％)。
　　锌　精密称取本品适量(约相当于锌0.1mg)，置10ml量瓶中，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释至刻度，作为供试品溶液；取供试品溶液与标准锌溶液(精密称取硫酸锌44mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，每lml相当于10μg的Zn)各1.6ml，分别置10ml量瓶中，各加硼酸-氯化钠缓冲液(pH9.0)2ml与新制的锌试剂溶液(取锌试剂0.13g，加氢氧化钠试液2ml溶解后，加水使成100ml)1ml，加水稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，照分光光度法(附录Ⅳ A)，在620nm的波长处分别测定吸收度，计算。含锌量不得过1.0％。
　　氯　取本品约10mg，精密称定，照氮测定法(附录Ⅶ D 第二法)测定，按干燥品计算，含氮量应为14.5％～16.5％。
　　干燥失重　取本品0.2g，在105℃干燥至恒重，减失重量不得过10.0％(附录Ⅷ L)。
　　炽灼残渣　取本品约0.4g，依法检查(附录Ⅷ N)，遗留残渣不得过2.0％。
　　无菌　取本品，加适量的灭菌0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含2mg的溶液，用薄膜过滤法处理后，依法检查(附录Ⅺ H)，应符合规定。
　　细菌内毒素　取本品，依法检查(附录Ⅺ E)，每1mg重组人胰岛素中含内毒素的量应小于10EU。

    【效价测定】照高效液相色谱法(附录Ⅴ D)测定。
　　色谱条件与系统适用性试验　用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5～10μm)；0.2mol/L硫酸盐缓冲液(取无水硫酸钠28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7ml、水800ml，用乙醇胺调节pH值至2.3，加水至1000ml)-乙腈(74：26，或适宜比例)为流动相；流速为每分钟1.0ml；柱温为40℃；检测波长为214nm。取系统适用性试验用溶液(取重组人胰岛素对照品，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含1mg的溶液，室温放置至少24小时)注入液相色谱仪，胰岛素主峰和A21脱氨胰岛素峰之间的分离度应不小于1.8，拖尾因子应不大于1.8。
　　测定法　取本品适量，精密称定，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml中含10.0单位的溶液(临用新配)。取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取重组人胰岛素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算。

    【类别】降血糖药。

    【贮藏】遮光，密闭，在－15℃以下保存。

    【制剂】(1)重组人胰岛素注射液　(2)精蛋白重组人胰岛素注射液